細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、侵襲性、對(duì)殺傷因素敏感性等項(xiàng)目的重要技術(shù)方法。

一、實(shí)驗(yàn)原理

接種細(xì)胞后，只有同時(shí)具有貼壁和增殖活力的細(xì)胞才會(huì)形成克隆。克隆形成率反映細(xì)胞的獨(dú)立生存能力的強(qiáng)弱，用于評(píng)價(jià)細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，在進(jìn)行測(cè)定時(shí)需要將接種的單個(gè)細(xì)胞分散為懸液，并直接接種在培養(yǎng)皿中進(jìn)行持續(xù)一周以上的培養(yǎng)，并在此期間進(jìn)行檢查。當(dāng)出現(xiàn)新的、由單個(gè)原始生長(zhǎng)出來(lái)的完整幾何結(jié)構(gòu)時(shí)，則可以停止培養(yǎng)過(guò)程。

克隆形成依據(jù)采用的培養(yǎng)介質(zhì)的不同，分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 平板克隆實(shí)驗(yàn)（以6孔板為例）

（1）將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化后，wanquan培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清）重懸成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)；

（2）細(xì)胞接種：于6孔板培養(yǎng)板中各實(shí)驗(yàn)組接種400-1,000個(gè)細(xì)胞/孔（根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況確定，一般為700個(gè)細(xì)胞/孔）;

（3）繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止，中途每隔3天進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)；

（4）克隆完成后，在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次；

（5）每孔加入結(jié)晶紫染液1ml，染細(xì)胞10-20 min；

（6）PBS 洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干，數(shù)碼相機(jī)拍照（分別對(duì)整個(gè)六孔板及每個(gè)孔進(jìn)行單獨(dú)拍照）。

2. 軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)

（1）配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓滅菌后，維持在42℃中使其不會(huì)凝固；

（2）將1.2% 瓊脂與2×培養(yǎng)基混合，鋪入6孔板作為下層膠，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

（3）將制備好的單細(xì)胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培養(yǎng)基，每3天更換一次；

（4）根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度培養(yǎng)2~3周后顯微鏡下觀察克隆大小，與平板克隆一樣，每個(gè)克隆>50個(gè)細(xì)胞，顯微鏡拍照。若拍整個(gè)孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）染色，37°C過(guò)夜，拍照。

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